:农业部动物疫病防控重点开放实验室用戊二醛癸甲溴铵溶液对高致病性蓝耳病病毒(PRRSV)进行了体外杀灭效果试验,其结果显示:大于或等于0.01%浓度的戊二醛癸甲溴铵溶液,可以完全杀灭PRRSV。因此建议该消毒剂对PRRSV临床使用的浓度为0.01%,即110 000稀释,根据具体情况,在有必要时应适当提高使用浓度。

关键词:高致病性蓝耳病病毒;戊二醛癸甲溴铵溶液;体外杀灭效果

    随着畜牧养殖业的迅速发展,为了做好各种动物传染疫病的防制措施,消毒工作是重要环节,防疫人员越来越重视和广泛使用消毒剂对动物厩舍及周围环境进行消毒。

    消毒剂种类繁多,常用的有醛类、酚类、醇类、酸类、卤素类、过氧化物类、表面活性剂和染料类等。消毒剂所含成分和含量的不同决定了它对病原微生物是否有杀灭作用以及完全杀灭所需的剂量[1]。笔者用戊二醛癸甲溴铵溶液对高致病性蓝耳病病毒进行体外杀灭效果测定,以确定该消毒剂杀灭以及完全杀灭PRRSV的最低剂量。

1、试验材料

   1.1 受试样品

   受试样品为戊二醛癸甲溴铵溶液,该溶液是无色澄清液体,含量规格:100 mL:戊二醛5g+癸甲溴铵5g,由广东卡乐汇国际动物药业股份有限公司提供, 批号:11080401

   1.2病毒毒株 

   测定所用病毒为高致病性蓝耳病病毒(PRRSV),由农业部动物疫病防控重点开放实验室提供[3,4]

   1.3 动物细胞

   猴肾细胞(Marc-145),由农业部动物疫病防控重点开放实验室保存提供。

2、试验方法:将FBS稀释成不同的浓度,将细胞培养板中培养液吸出,然后把每个浓度的消毒剂注入细胞培养板。

   2.1 Marc-145细胞对戊二醛癸甲溴铵溶液的感受性试验

   将戊二醛癸甲溴铵溶液用3%剂量,分别注入细胞的相应四个孔内, 每孔1 mL。对照组: 只加3% FBS。置37℃,含5% CO2培养箱中,连续培养5 d,每天观察。本试验重复3次。

   2.2消毒剂对PRRSV的杀灭试验

   试验组:用DMEM将消毒剂稀释成不同浓度,将PRRSV 原液( TCID50 =104.2/ 0.1mL)稀释2倍,与等量不同浓度的消毒剂混合;置20℃感作20 min,再分别用3% FBS稀释103倍,当消毒剂浓度小于或等于0.001%时,接种到细胞上的病毒仍能够导致细胞产生病变,但不影响细胞正常生长。然后将细胞培养板中培养液吸出,把上述稀释好的消毒剂与病毒混合液按消毒剂浓度大小分别依次加入相应孔中,即消毒剂与PRRSV 混合液加入Marc-145 细胞培养板孔中; 每个浓度接种四个孔,每孔1mL。对照组:阴性对照为3% FBS 阳性对照为2×103 倍稀释的PRRSV液(3% FBS稀释);消毒剂对照为0.001%的消毒液(3% FBS稀释)。对照组的每孔加入量为1mL。然后置37℃,含5% CO2培养箱中,连续培养57d。每天观察。本试验重复5次。

3、试验结果

   3.1 Marc-145细胞对戊二醛癸甲溴铵溶液的感受性试验

   结果见表1

    结果表明,试验组消毒剂浓度小于或等于0.001%时,对PK-15细胞的生长无明显影响,即细胞正常生长,消毒剂浓度大于或等于0.01%时,对细胞生长有不同程度的影响,即细胞生长异常,发生萎缩、脱落、死亡、崩解等,3% FBS对照组,细胞正常生长。

    3.2 戊二醛癸甲溴铵溶液对PRRSV杀灭效果试验

    结果见表2

结果表明,大于或等于0.01%浓度的戊二醛癸甲溴铵溶液可杀灭PRRSV, 使PK-15细胞不受病毒感染, 不产生细胞病变,而且细胞能正常生长;0.001%浓度的戊二醛癸甲溴铵溶液对PRRSV不完全杀灭,致使细胞产生病变或生长异常;小于或等于0.0001% 浓度的戊二醛癸甲溴铵溶液不能杀灭病毒,致使细胞产生圆缩、空泡、融合、脱落等病变。在3% FBS 0.001% 戊二醛癸甲溴铵溶液对照组,细胞生长正常;在病毒对照组,细胞受相应病毒感染,产生典型细胞病变。

4、分析与讨论

   戊二醛为醛类消毒药,可杀灭细菌的繁殖体和芽孢、真菌、病毒等;癸甲溴铵为双长链阳离子表面活性剂,其季铵阳离子能主动吸引带负电荷的细菌和病毒,并覆盖其表面,阻碍细菌代谢,导致膜的通透性改变,协同戊二醛更易进入细菌、病毒内部,破坏其蛋白质和酶活性,达到快速高效的消毒作用[2]

   按照国家标准指导用量,戊二醛癸甲溴铵溶液需在临用前用水按0.025%~0.2%比例稀释后喷洒或浸泡消毒。喷洒剂量:常规环境消毒,12 0004 000稀释, 。疫病发生时环境消毒剂量:,15001 000。浸泡剂量:(器械、设备等消毒)11 5003 000[2,3]

5、结论 

      本测定结果显示大于或等于0.01%浓度的戊二醛癸甲溴铵溶液可体外杀灭PRRSV,故建议该消毒剂对PRRSV临床使用浓度为≥0.01%,即110000稀释,但同时也要根据具体情况,有必要时应适当提高使用浓度。 

参考文献:

[1] 陈杖榴主编. 兽医药理学(第二版)[M]. 中国农业出版社. 2002. 251-263

[2] 农业部兽药评审中心编. 兽药国家标准汇编(第二册)[M]. 中国农业出版社. 2011.181

[3] 中国兽药典委员会编. 中华人民共和国兽药典(2010年版)[M]. 中国农业出版社. 2011.附录

[4] 农业部兽药评审中心. 兽药研究技术指导原则[S]. 2010.127

【作者介绍】

李云:卡乐汇国际药业技术副总经理,兽医专业博士研究生,执业兽医师。毕业于华南农业大学兽医学院,研究方向为动物药品与功能性饲料添加剂配方工艺与检测技术研究以及兽药残留与动物源性食品安全研究。

贾伟新:华南农业大学动物生物安全三级实验室安全负责人,预防兽医学博士,高级实验师,硕士研究生导师。主要从事“禽病学”、“普通兽医学”、“禽病学综合实验技术”等课程的教学和家禽主要疫病流行病学、家禽临床疾病诊断及实验室生物安全方面的研究工作。